Определение глюкозы глюкозооксидазным методом

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в лабораториях.

Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и моче основанн на реакции окисления глюкозы в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь в присутствии пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенных продуктов; о концентрации глюкозы сулят по количеству окрашенных продуктов.

Поскольку глюкозооксидазный метод направлен на выявление именно глюкозы, а не всех видов сахаров, его применяют в дифференциальной диагностике следующих заболеваний:

• пентозурия
• непереносимость лактозы
• наследственный синдром непереносимости фруктозы
• изолированная фруктозурия

Принцип глюкозооксидазного метода определения глюкозы

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляет­ся кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолуидин образованием окрашенного соедине­ния, интенсивность окраски которого пропорциональна содержа­нию глюкозы. Данный метод позволяет определить уровень глюкозы в плазме крови, сыворотке и спинномозговой жидкости.

Врачи отмечают, что глюкозооксидазный метод определения глюкозы является одним из наиболее точных и надежных способов диагностики уровня сахара в крови. Этот метод основан на реакции глюкозы с глюкозооксидазой, в результате которой образуются перекись водорода и глюконовая кислота. Перекись водорода затем взаимодействует с пероксидазой, что приводит к образованию цветного соединения, интенсивность которого пропорциональна концентрации глюкозы. Специалисты подчеркивают, что данный метод обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, что особенно важно для пациентов с диабетом. Кроме того, глюкозооксидазный метод позволяет проводить анализы как в лабораторных условиях, так и с использованием портативных устройств, что значительно упрощает мониторинг уровня глюкозы в домашних условиях. Врачи рекомендуют регулярное использование этого метода для контроля состояния здоровья и предотвращения осложнений, связанных с нарушением углеводного обмена.

Определение концентрации глюкозы в слюне энзиматическим колориметрическим методом

Нормальное содержание глюкозы в крови, ммоль/л

— в плазме, натщесерце

• новорожденные — 1,7 — 4,2
• дети от 6 недель до 15 лет — 3,3 — 5,4
• взрослые (мужчины, женщины) — 3,9 — 5,6

 — в сыворотке крови, натщесерце

• новорожденные — 2,6 — 4,2
• дети от 6 недель до 2 лет — 3,3 — 5,4
• взрослые (мужчины, женщины) —  3,9 — 5,6

Необходимые реактивы для определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Натрия хлорида 9 грамм/литр(изотонический раствор): готовят, раст­воряя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворя­ют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодиль­нике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имею­щийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 литре).

6. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить не­сколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начи­нает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточ­но чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предваритель­но высушивают при температуре 37°С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раство­ра (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

Определение глюкозы глюкозооксидазным методом вызывает множество положительных отзывов среди специалистов в области медицины и лабораторной диагностики. Этот метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет точно измерять уровень глюкозы в крови. Многие врачи отмечают его удобство в использовании, так как он не требует сложной подготовки образцов и может быть выполнен в условиях стационаров и поликлиник.

Пациенты также ценят этот метод за его быстроту и надежность, что особенно важно при мониторинге диабета. Однако некоторые эксперты подчеркивают необходимость регулярной калибровки оборудования и контроля качества реактивов, чтобы избежать возможных погрешностей в результатах. В целом, глюкозооксидазный метод остается одним из самых популярных и востребованных в клинической практике.

Глюкозооксидазный

Ход определения глюкозы глюкозооксидазным методом

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гид­рата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровоч­ного раствора, снова перемешивают и через 10 минут центрифуги­руют при скорости 3000 об./мин в течение 10 минут.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реак­тива и осторожно перемешивают.

Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13-15 минут, а затем постепенно умень­шается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия.

При приготовлении калибровочного гра­фика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет уровня глюкозы можно проводить по правилу пропорций или по калиб­ровочному графику, для построения которого на одной оси откла­дывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой — величи­ну экстинкции.

Примечания к методика определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотониче­ский раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфа­та цинка и NaOH.

2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно еже­дневно обрабатывать холостую пробу и 2-3 точки в диапазоне 3-9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.

Определение глюкозы глюкозооксидазным методом

Вопрос-ответ

Что такое глюкозооксидазный метод?

Глюкозооксидазный метод — это аналитический метод, используемый для количественного определения глюкозы в биологических образцах, таких как кровь или моча. Он основан на реакции глюкозы с глюкозооксидазой, в результате которой образуется перекись водорода, которая затем может быть измерена с помощью различных методов, например, колориметрического или электродного. Этот метод широко применяется в клинической практике для мониторинга уровня глюкозы у пациентов с диабетом.

Как используется метод глюкозооксидазы для определения уровня глюкозы?

Фермент глюкозооксидаза реагирует с глюкозой, водой и кислородом, образуя глюконовую кислоту и перекись водорода. Перекись водорода затем может быть использована для окисления хромогена, а потребление кислорода может быть измерено для оценки количества присутствующей глюкозы.

Каким методом определяют глюкозу?

Метод исследования — колориметрический, — гексокиназный, — редуктометрический. Первый метод определения концентрации глюкозы наиболее распространен и основан на применении фермента глюкозооксидазы, который при соприкосновении с глюкозой образует перекись водорода.

Какой самый точный анализ на глюкозу?

Гликированный гемоглобин отражает изменения глюкозы в крови за предыдущие 3 месяца перед анализом. Это наиболее точный и быстрый метод выявления сахарного диабета, рекомендованный ВОЗ для диагностики заболевания. С его помощью выявляется даже скрытое течение диабета.

Советы

СОВЕТ №1

Перед проведением анализа убедитесь, что все необходимые реактивы и оборудование находятся в исправном состоянии. Это поможет избежать ошибок в измерениях и обеспечит точность результатов.

СОВЕТ №2

Обратите внимание на условия хранения и срок годности реактивов. Использование просроченных или неправильно хранящихся веществ может привести к искажению результатов анализа.

СОВЕТ №3

При проведении анализа строго следуйте протоколу, включая время инкубации и температуру. Небольшие отклонения могут существенно повлиять на конечный результат.

СОВЕТ №4

Регулярно проводите калибровку оборудования и проверку точности метода с помощью контрольных образцов. Это поможет поддерживать высокую надежность и воспроизводимость ваших измерений.